（一）立項依據與研究內容（4000-8000字）：

Ⅰ.項目的立項依據（研究意義、國內外研究現狀及分析，附主要參考文獻目錄。）

肝細胞肝癌(hepatic cellular carcinoma，HCC，以下簡稱肝癌)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年新發病56.4萬例，其中42. 5%發生在中國，且有上升趨勢[1]。自20世紀90年代起肝癌在我國已為第二位癌癥殺手，其死亡率為20.4/10萬，占全部惡性腫瘤的18.8%[2]。國內外研究結果表明，HBV 持續感染是肝癌最重要的病因之一[3]。全世界乙型肝炎病毒慢性感染者估計有3.5億- 4億，其中約25%最終發展為肝硬化和肝癌。WHO肝癌預防會議指出：HBV 感染與肝癌相關性高達80%[4]。在我國肝癌90%以上有HBV感染的血清學證據，乙型肝炎患者發生肝癌的機率比正常人群高5-30倍[5]。由此可見HBV 感染與肝癌的因果關系密切。甘肅省屬于乙肝高發地區，乙肝發病率大大超過全國10％的平均水平，近年發病率在133/10萬左右，是全國平均發病率的3倍，2001年居全省各類傳染病發病首位。目前全省至少有260萬人為乙肝病毒攜帶者，每年至少有3萬人感染乙肝病毒。肝硬化和肝癌的發病率也遠高于全國平均水平(甘肅省衛生廳疾控處, 2006)。因此探討中國甘肅地區乙肝相關肝癌的發病機制、遺傳易感因素具有重要的醫學價值。

Joo HY 等研究表明HBV 誘導肝癌的機制主要涉及HBV 的DNA 與肝細胞基因組的整合以及乙肝病毒X蛋白（HBx）的致癌作用[6]。HBx 是乙肝病毒X 基因的表達產物, 具有反式激活功能, 可通過從轉錄水平激活細胞生長調節基因、調節細胞調亡、抑制受損DNA 的修復等機制導致肝癌的發生, HBx 的這些作用通過其與細胞內其他蛋白質的相互作用以及激活細胞內的信號傳導通路來實現[7]。近年來，環氧合酶（cyclooxygenase-2，COX-2）作為一個非常重要的腫瘤相關基因，得到了廣泛的重視。大量研究發現COX-2 在人類多種惡性腫瘤組織中都有較高水平表達，肝癌中也發現COX-2 異常表達[9]。通過抑制腫瘤細胞凋亡、促進腫瘤組織血管生成以及提高腫瘤細胞的擴散能力等機制,參與肝癌等多種腫瘤的發生與發展[10] [11]。Cheng 等研究發現轉染了HBx 的Hep3B 肝癌細胞株中COX-2 表達和PGE2 合成均增強，提示HBx 可能通過促COX-2 作用機制導致肝癌的發生、發展[8]。

J. Ke 和Kyung-Soo 等研究證實，在COX-2 基因5′端包含一個保守的啟動子元件TATA 盒和多個順勢調控元件，包括白細胞介素6 核因子(NF-IL-6)、激活蛋白-2 (AP-2)、Sp1 ( specific protein1 )、核轉錄因子-κB(NF-κB)、CRE ( cAMP 反應元件)等[12] [13]。這些區域調控元件的突變或缺失能減少COX-2 的表達，相反激活這些調控元件能夠增加COX-2 的表達。COX-2 表達的調控主要在轉錄水平上，即細胞受到刺激后經過一系列信號轉導并作用于5′ 端轉錄，誘導COX-2 表達。這些刺激因素存在于細胞內外，主要有某些細胞因子、生長因子、炎性介質、致癌劑（如TPA：12-O-十四烷酰佛波醋酸酯-13）及一些癌基因產物等。它們主要是通過蛋白激酶C(PKC) 和RAS 介導的途徑來調控COX-2 的轉錄[14] [15]。研究發現慢性乙型肝炎病毒可活化NF-κB，在Hep3B 細胞中, NF-κB 活化后,上調了COX-2 的活化和誘導[16]。



COX-2 被認為是一種腫瘤抗凋亡分子，主要通過其催化生成的前列腺素E2(PGE2) 起作用，PGE2 與腫瘤細胞上的前列腺素受體（EP1-4）結合，通過G 蛋白偶聯途徑即EP/cAMP 途徑來激活細胞內的各種激酶，促進細胞增殖[17]。研究發現COX-2 特異性抑制劑NS-398 誘導HepG2 細胞凋亡時, bcl-2 蛋白表達水平呈劑量依賴性下降，而Caspase3 蛋白表達增加。因此推測COX-2 可能通過調節bcl-2 蛋白的表達抑制Caspas3，促進肝癌HepG2 細胞增殖[18]。bcl-2 家族是最重要的凋亡調節因子之一,其中bcl-2 是第一個被確認有抑制凋亡作用的基因[19]。bcl-2 在線粒體膜上形成蛋白孔道使細胞線粒體跨膜電位下降，細胞色素C 釋放，激活Caspase 蛋白酶級聯反應[20]。凋亡蛋白酶 (Caspase) 是一組對底物天冬氨酸部分有特異水解作用的富含半胱氨酸的蛋白酶，而Caspases 家族成員中研究最多、功能相對較明確的為Caspase3，在細胞內以無活性的前體(酶原)形式存在, 被激活后在細胞凋亡中發揮關鍵作用。Caspase3 為凋亡的效應分子,是凋亡途徑下游進行底物酶解的關鍵蛋白酶,被稱為凋亡的“執行者”。

遺傳易感性在乙肝相關性疾病(乙肝、乙肝后肝硬化、乙肝相關性肝癌)的發生發展中的作用受到研究者的廣泛關注。人群中存在易感個體是由于一些與乙肝相關性疾病發生相關的基因存在多態性，最常見的是單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)。綜合目前世界上相關報道：COX-2在惡性腫瘤中的表達率，在不同地域以及不同種族、人群中存在差異[21]。研究發現COX-2基因多態性會改變酶的表達水平或其的生化功能，對前列腺素的生物合成產生重要影響，從而使腫瘤的易感性升高或下降。COX-2基因有些多態位點可以改變個體對炎癥性疾病和惡性腫瘤的發病風險 [22-27]。目前已發現COX-2基因啟動子區域的-765G/C、-899G/C 、-1195G/A、-1290A/G基因突變（SNP）與大腸癌[22]、前列腺癌[23]、膽管癌[24]、胃癌[25][26]、食管癌[27]等多種惡性腫瘤的發病風險相關。我們課題組前期的研究發現：COX-2基因啟動子區-765G/C多態性與甘肅人群胃癌、乙肝相關性肝癌易感性相關[28-30]。研究表明COX-2 -765 bp正好均位于 COX-2 基因的啟動子區的SP-1結合位點[31] ， SP-1是一個O-糖基化的正性轉錄調節因子, 通過識別富含G的10個核苷酸長度的同源序列5'-GGGGCGGGGC-3'， (如GC盒)而起作用[32]。  因此，在此區域的堿基改變，如G/C多態性，可能會影響SP-1與啟動子區域相應反應元件的結合，進而影響COX-2轉錄水平。研究證實與COX-2- 765 GG型相比，CC型攜帶者啟動子活性降低 -30%[33]。這種改變可能會影響COX-2 的轉錄和表達，進而改變了機體對腫瘤的易感性[23]。

為了進一步明確COX-2基因啟動子區-765G/C多態性如何影響乙肝相關性肝癌發生的易感性，本課題擬對這兩個多態位點進行功能研究，以COX-2 凋亡信號轉導通路為線索，試圖闡明-765G/C多態性對肝癌細胞增殖、凋亡的影響。并為進一步針對基因多態性位點進行有效的基因治療奠定理論基礎。   





參　考　文　獻

[ 1 ] Bosch FX, Ribes J, Cleries R, et al. Epidemiology of hepatocellular carcinoma. Clin Liver Dis, 2005, 9(2): 191-211.

[ 2 ] Ratain MJ. Insights into the phamacokinetics and pharmacodynamits of irinotecan[J]. Clin Cancer Res, 2000, 6(9): 3393—94.

[ 3 ] Ma Mk, Mcleod HL. Lessons learned from the irinotecan metabolic pathway[J], Curr Med Chem, 2003, 10(1): 41—49.

[ 4 ] WHO: 《國際癌癥控制計劃：政策和管理指南》.

[ 5 ] Tabor E, Gerely RJ, Voegel CL, et al. Hepatitis B virus infection and primary hepatocellular carcinoma [J], Natl Cancer Inst, 1997, 58(5): 1197.

[6] Joo HY, Han KH, Ryu WS1 Gene expression profile in response to hepatitis B virus X gene by using an adenoviral Vector [J]. Taehan Kan Hakhoe Chi ,2002 ,8 (4) : 371 -380.

[8] Jin YM, Yun C , Park C ,et al1 Expression of hepatitis B virus X protein is closely correlated with the high periportal inflammatory activity of liver diseases [J ] . J Viral Hepat, 2001, 8 (5) :322 – 330.

[8] Cheng AS, Chan HL, Leung WK, et al. Expression of HBx and COX-2 in chronic hepatitis B, cirrhosis and hepatocellular carcinoma: implication of HBx in up-regulation of COX-2[J]. Mod Pathol, 2004, 17(10):

[ 9 ] Shiota G, Okubo M, Noumi T, et al. Cyclooxygenase-2 expression in hepatocellular carcinoma[J]. Hepatogastroenterology, 1999, 46(25) :407-412.

[ 10 ] Qiu DK, Ma X, Peng YS, et al. Significance of cyclooxygenase–2 expression in human primary hepatocellular carcinoma[J]. World J Gastroenterol, 2002, 8(5): 815-817.

[ 11 ] 王昆，邢寶才，張青云，徐光煒. 環氧合酶-2 在肝癌細胞系中的表達研究中華普通外科雜志.2003，18 （2）；107-108　

[12] J. Ke, X. Long, Y. Liu, Y.F. Zhang, J.Li, W. Fang, and Q.G. Meng. Role of NF-kB in TNF-a-induced COX-2 Expression in Synovial Fibroblasts from Human TMJ. J Dent Res 2007,86(4):363-367.

[13] Kyung-Soo Chun, Su-Hyeong Kim, Yong-Sang Song and Young-Joon Surh. Celecoxib inhibits phorbol ester-induced expression of COX-2 and activation of AP-1 and p38 MAP kinase in mouse skin Carcinogenesis vol.25 no.5 pp.713--722, 200

[14] Subbaramaiah K,Norton L ,Gerald W, et al . Cyclooxygenase22 is overexpressed in HER22Pneu2positive breast cancer. Evidence for involvement of AP21 and PEA3 [J] .J Biol Chem, 2002, 277 (21): 18649-18657.

[15] Zhang F ,Subbaramaiah K,Altorki N , et al . Dihydroxy bile acids activate the transcription of cyclooxygenase-2[J]. J Biol Chem, 1998, 273(4) :2424-2428.

[16] Lara - Pezzi E , Gomez - Gaviro MV , Galvez BG, et al. The hepatitis B virus X protein promotes tumor cell invasion by inducing membrane - type matrix metalloproteinase – 1 and cyclooxygenases - 2 expression [ J ] J Clin Invest , 2002 ,110 (12) :1831 - 18381

[17] Lori C. Sakoda , Yu-Tang Gao, Bingshu E. Chen，et al. Prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (PTGS2) gene polymorphisms and risk of biliary tract cancer and gallstones: a population-based study in Shanghai, China. Carcinogenesis. 2005,12 (16):1093-1103

[18] 呂必華，張玲，劉靜.COX-2抑制劑NS-398對肝癌HepG2細胞凋亡蛋白Bcl-2和Caspase 3表達的影響.公共衛生與預防醫學.2007，18（4）；21-24.

[19] Anto RJ, MukhopadhyayA, Denning K, et al. Curcumin ( diferuloylmethane) induces apoptosis through actvation of caspase8,BID cleavage and cytochrome C release: its suppression by ectopic expression of bcl-2 and bcl-xl[J]. Carcinogenesis, 2002, 23(1): 143-150.

[20] Yang J , Liu X ,Bhalla K, et al. Prevention of apoptosis by Bcl-2: Release of cytochrome c from mitochondria blocked[J]. Science ,1997, 275: 1129 - 1132.

[21] Saukkonen K, Rintahaka J, Sivula A, et al. Cyclooxygenase-2 and gastric carcinogenesis. APMIS, 2003; 111(10): 915–925.

[22] 譚文, 吳健雄, 張雪梅,等. 環氧化酶-2和脂氧合酶-12基因多態與大腸癌發病風險以及進展關系的研究[A]. 第四屆中國腫瘤學術大會暨第五屆海峽兩岸腫瘤學術會議論文集 [C], 2006

[23] Ramesh C.K. Panguluri, Layron O. Long, Weidong Chen，et al. COX-2 gene promoter haplotypes and prostate cancer risk Carcinogenesis, 2004,2596):961-966

[24] Lori C. Sakoda , Yu-Tang Gao, Bingshu E. Chen，et al. Prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (PTGS2) gene polymorphisms and risk of biliary tract cancer and gallstones: a population-based study in Shanghai, China. Carcinogenesis . 2005,12(16):1093-1103

[25] 朱克祥, 李玉民, 李 汛, 等. COX-2基因多態性及H pylori 感染與胃癌高發區甘肅河西地區胃癌的相關性. 世界華人消化雜志 2008;16(21): 2364-2370.

[26] 高君, 柯巧, 王燕，等. 環氧化酶-2(COX-2)基因多態性與胃癌易感性的關聯研究[A]. 第四屆中國腫瘤學術大會暨第五屆海峽兩岸腫瘤學術會議論文集 [C], 2006

[27] 郭永麗, 林東昕. 血小板型12-脂氧化酶和環氧化酶-2基因功能性多態與食管鱗癌風險[A]. 第四屆中國腫瘤學術大會暨第五屆海峽兩岸腫瘤學術會議論文集 [C], 2006

[28] 張丹.胃癌高低發區COX-2、PARP-1基因多態性與胃癌相關性的研究[D]. 蘭州大學, 2009 [9] 27-28.

[29]唐小凡, 李玉民, 李世雄, 等. Cox-2、Parp-1基因多態性與回族人群胃癌易感性的關聯研究[J].世界華人消化雜志, 2009, 17(17): 1772-1776.

[30] He J, Zhang Q, Ren Z, Li Y, Li X, Zhou W, Zhang H, Meng W, Yan J, He W. Cyclooxygenase-2 -765 G/C polymorphisms and susceptibility to hepatitis B-related liver cancer in Han Chinese population. Mol Biol Rep. 2012 Apr;39(4):4163-8.

[31] Pereira C, Sousa H, Ferreira P, Fragoso M, Moreira-Dias L, Lopes C, et al. -765G > C COX-2 polymorphism may be a susceptibility marker for gastric adenocarcinoma in patients with atrophy or intestinal metaplasia.World J Gastroenterol. 2006;12:5473-5478.

[32] Ke-Xiang Z, Yu-Min L, Xun L, Wen-Ce Z, Yong S, Tao L.Study on the association of COX-2 genetic polymorphisms with risk of gastric cancer in high incidence Hexi area of Gansu province in China. Mol Biol Rep. 2011 Jan;38(1):649-55. 

[33] Corella, D., J.I. Gonzalez, M. Bullo, et al., Polymorphisms cyclooxygenase-2 -765G>C and interleukin-6 -174G>C are associated with serum inflammation markers in a high cardiovascular risk population and do not modify the response to a Mediterranean diet supplemented with virgin olive oil or nuts. J Nutr, 2009. 139:. 128-134.



Ⅱ.項目的研究內容、研究目標,以及擬解決的關鍵問題。

研究內容

1.采用基因測序方法檢測乙肝相關肝癌患者的組織標本中COX-2基因 -765G/C單核苷酸多態性，分型歸納組織標本。

2. 采用RT-PCR檢測 COX-2 -765 GG、GC、CC 基因型患者肝癌組織COX-2 的mRNA 轉錄水平差異。  檢測 COX-2 -765 G/G不同 基因型患者肝癌組織中 COX-2、PGE2 及下游分子bcl-2、caspase3 的蛋白表達水平，揭示COX-2   -765G/C不同基因型對肝癌細胞增殖、凋亡的影響作用。

3. 對COX-2 -765 GG、GC、CC 基因型肝癌患者的臨床病理特征（病灶數目、大小、包膜完整性、門靜脈癌栓、BCLC分期）進行分析，明確-765 G/C對肝癌臨床病理進展的影響。

4.分離原代培養COX-2 -765不同基因型肝癌細胞，觀察COX-2 -765 G/G各基因型細胞增殖、凋亡水平差異；檢測COX-2 -765 G/G各 基因型細胞中 COX-2、PGE2 、bcl-2、caspase3 的蛋白表達水平差異，體外驗證 COX-2   -765G/C不同基因型對肝癌細胞增殖、凋亡的影響作用。



研究目標

1. 明確COX-2 基因啟動子區-765G/C多態性對COX-2 下游涉及增殖、凋亡相關分子的表達水平的影響，以及乙肝相關肝癌臨床病理進展的關系；

2.揭示COX-2 基因啟動子區-765G/C多態性的生物遺傳學意義，為針對該多態位點設計相應的基因干預治療奠定基礎。

擬解決的關鍵問題

1．分離并原代培養COX-2  -765 GG、GC、CC 基因型患者肝癌組織中的肝癌細胞進行干預實驗；

2. 闡明 COX-2  -765G/C多態性對肝癌細胞增殖、凋亡的影響。







Ⅲ.擬采取的研究方案及可行性分析。

研究方法

1. 研究對象：選擇甘肅省常住人口（超過15年），確診為原發性肝癌 患者若干例。(既往乙肝病史，血清學檢查陽性，臨床檢驗、影像學或病理學均確診)。同時采集流行病學和臨床病理資料，每位對象被告知研究細則，并簽署知情同意書，調查表包括以下信息： a.人口學特征，如年齡、性別等；b.其他肝膽疾病病史及使用藥物、毒物接觸情況；c.吸煙史、飲酒史和生活飲食習慣；d.肝癌家族史：研究對象至少有一個直系親屬（包括父母、兄弟或姐妹）是肝癌患者。臨床病理資料包括：病灶數目、大小、包膜完整性、門靜脈癌栓、BCLC分期等。

2. 采集標本：實施肝癌手術的患者留取肝癌組織標本，分別進行-20攝氏度凍存、-196攝氏度液氮凍存和福爾馬林固定、石蠟包埋制片。

3.  單核苷酸多態性分析：對-20攝氏度凍存肝癌組織標本，提取DNA，采用基因測序法對COX-2 基因的啟動子區-765G/C多態進行檢測，根據檢測結果，將獲取組織標本按照COX-2  -765 GG、GC、CC 基因型分組，保證各組10例以上。

4.  采用熒光定量RT-PCR法檢測COX-2 的mRNA 在-765 G/G 各基因型癌組織中表達水平。

5.  分別采用免疫組化和western blot法檢測肝癌組織標本中COX-2、PGE2 、bcl-2、caspase3 的表達水平。

6.  細胞實驗：從COX-2  -765 GG、GC、CC 各基因型肝癌組織標本中分離、并原代培養肝癌細胞。

7.  RT-PCR法檢測-765 GG、GC、CC 各基因型原代肝癌細胞中COX-2 的mRNA的表達差異。

8. 分別采用細胞免疫化學和western blot 法檢測-765 GG、GC、CC 各基因型原代肝癌細胞中 COX-2、PGE2 、bcl-2、caspase3 的表達水平。

9.  采用CCK-8 檢測-765 GG、GC、CC 各基因型原代肝癌細胞增殖水平差異；采用Anexin-V和PI 雙染法檢測各組肝癌細胞凋亡差異。

10. 統計分析：運用SPSS17.0軟件進行統計分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

技術路線及實驗流程見下表：























                                     













                                 



                                 

















可行性分析：

1． 目前SNP 的研究已經涉及到代謝酶基因、DNA修復基因、致癌物基因、癌基因、抑癌基因等方面�；�因多態性與肝癌的發病機制倍受國內外學者的關注。

2． 甘肅肝癌發病率較高，可以得到大量的實驗標本，也可得到對照組的對照標本，開展此項研究有很大的便利性。研究手段及熒光定量PCR、West blotting等實驗方法已成為常規的分子生物學研究方法。

3． 我院與蘭州大學第一醫院建立密切合作關系，蘭州大學第一醫院設有甘肅省肝膽胰研究所、甘肅省分子生物學研究所、蘭州大學臨床醫學院腫瘤研究所等，項目實驗所需設備齊全，專業的科研人員可以保證實驗的嚴謹性和可靠性。

4． 本單位從事基因研究多年，擁有全套設備；該研究團隊在肝癌發病研究中做了大量的工作、具有很強的科研能力；承擔了多項國家級、省部級科研項目，具有良好的科研素質，作風嚴謹，能夠吃苦耐勞，而且高、中、初級人員結構合理，這是完成該項目的重要人力保障。



Ⅳ. 本項目的特色與創新之處。

1. 明確COX-2 基因啟動子區-765G/C多態性對COX-2 及下游涉及增殖、凋亡相關分子的表達水平的影響，以及乙肝相關肝癌臨床病理進展的關系；

2. 分離并原代培養COX-2  -765 GG、GC、CC 基因型患者肝癌組織中的肝癌細胞進行干預實驗；



Ⅴ.年度研究計劃及預期研究結果。

年度研究計劃

1．2014年09月——2015年3月

完成乙肝后肝癌標本的采集及健康志愿者標本的采集和乙肝后肝癌患者流行病學的臨床資料采集工作；對各組織標本分類保存；進行預實驗。

2．2015年04月——2017年4月

采用RT-PCR檢測 COX-2 -765 GG、GC、CC 基因型患者肝癌組織COX-2 的mRNA 轉錄水平差異。  檢測 COX-2 -765 G/G不同 基因型患者肝癌組織中 COX-2、PGE2 及下游分子bcl-2、caspase3 的蛋白表達水平，揭示COX-2   -765G/C不同基因型對肝癌細胞增殖、凋亡的影響作用。分離原代培養COX-2 -765不同基因型肝癌細胞，觀察COX-2 -765 G/G各基因型細胞增殖、凋亡水平差異；檢測COX-2 -765 G/G各 基因型細胞中 COX-2、PGE2 、bcl-2、caspase3 的蛋白表達水平差異，體外驗證 COX-2   -765G/C不同基因型對肝癌細胞增殖、凋亡的影響作用。

3．2017年5月——2017年12月

總結資料和實驗數據，進行統計學分析，撰寫論文，課題結題。



預期研究成果

1. 明確COX-2 基因啟動子區-765G/C多態性對COX-2 下游涉及增殖、凋亡相關分子的表達水平的影響，以及乙肝相關肝癌臨床病理進展的關系，揭示COX-2 基因啟動子區-765G/C多態性的生物遺傳學意義。

2. 發表文章：SCI論文2-3篇，國內核心期刊文章2-3篇。



(二）研究基礎與工作條件

1、工作基礎（與本項目相關的研究工作積累和已取得的研究工作成績）

本課題組于2000年至2008年進行了大量消化道腫瘤的研究。承擔了中科院、中組部“西部之光”項目——甘肅省河西地區胃癌高發相關因素及防治的研究。研究了甘肅省河西地區胃癌的流行病學狀況、發病特點，發病的危險因素以及環境、生物、化學因素對胃癌的影響。自2006年課題申請人首次進行了COX-2基因啟動子區基因多態性與乙肝相關性肝癌發病風險關系的研究，發現COX-2 -765G/C、-899 G/C多態性與乙肝相關肝癌發病相關，發表SCI論文2篇。

同時本項目合作者就病毒性肝炎流行病調查，發病機制及診斷治療方面做了大量研究工作，課題細胞因子TNF-α和IL-10-1082基因多態性與甘肅地區乙型、丙型肝炎病毒感染的相關性研究已經結題，達國內先進水平，獲得甘肅省科技進步二等獎。通過前期的研究工作，我們熟練掌握了基因多態性的分子生物學研究方法，與省內多家醫院取得密切聯系，建立了蘭州大學腫瘤防治中心分所9個（地級醫院6個、縣級醫院3個），可獲取豐富的病例及標本資料。

上篇：

下篇：